大家好，我是刘博，今天我们来探讨，为什么分子诊断会出现假阴性结果，以及我们需要采用什么样的质控措施来避免出现假阴性结果。
核酸检测结果被抑制的原因，一般是由于在反应体系当中存在某些物质，它们会对我们目标序列产生干扰，从而导致出现假阴性或者假阳性结果。
对于很多分子诊断试剂而言，都需要依赖酶的活性才能发挥作用（例如，DNA和RNA聚合酶，逆转录酶等等）。这些酶可能需要辅助因子或者在一些特定的条件下才能获得最佳活性，例如，酶促反应通常需要底物与与酶上的特定结合位点结合后，通过相互之间的物理作用（如范德华力）来实现。
如果在样品当中，存在一种物质可以与这些重要的辅助因子结合，或者可以改变局部环境，又或者可以阻挡酶的活性部分，那么在这种情况下，都有可能会抑制扩增反应，从而导致假阳性结果的出现。
样本当中的很多成分都可以通过与酶促反应的成分发生相互作用来抑制核酸的靶向扩增。例如，血红素及其代谢产物是已知的DNA聚合酶抑制剂；不同来源的聚合酶可能会受到不同浓度的影响；酸性多糖是存在于痰中的糖蛋白的成分，是已知的聚合酶的抑制剂；CSF、尿液和痰液也可能含有DNA聚合酶抑制剂，但其抑制性成分还没有被定性；粪便中的胆汁盐是PCR强抑制剂；抗凝血剂肝素与DNA聚合酶结合，是依赖这些酶的核酸扩增方法的强效抑制剂。
我们可以采用对样品进行的稀释方式，来减少抑制作用的存在，但这也有副作用，那就是由于目标DNA被稀释了，诊断试剂本身的灵敏度也可能会降低。如果我们需要评估一个分子诊断试剂的性能的话，可以考虑购买一些商业化的抑制检测血清盘，这样我们就可以在已知抑制物存在的情况下，对其进行评估。
这些抑制物质在采用直扩法的分子试剂当中会比较常见，但对于采用提取方法进行的实验而言，影响并不会太大，具体可见下文
还有一种可以有助于减少抑制的方法就是在反应体系中，加入对目标序列的捕获步骤，这样我们就可以在扩增前去除潜在的抑制基质成分。在有些提取方法当中，还包括有纯化步骤，可以将核酸与样品中的其他物质相分离。
在临床样品当中，也可能含有核酸酶，会将目标核酸降解，从而导致目标核酸无法被检测到。此外，许多用于纯化核酸的试剂（如苯酚、EDTA、十二烷基硫酸钠等洗涤剂、有机溶剂、盐酸胍等变色剂）如果与目标核酸共存，可能对扩增酶有抑制作用。另外，实时PCR扩增中使用的高浓度的荧光双链DNA（dsDNA）插层染料也会产生抑制作用。
对于多重反应而言，它会面临另外一种抑制作用，当一个目标序列对脱氧核苷三磷酸酯（dNTPs）或其他基本反应成分的竞争超过另一个目标时，就会发生竞争性抑制，这会导致第二个目标序列无法被检测到。
我们还可以考虑使用各种促进剂来加强扩增反应并限制抑制剂的影响，例如，甲酰胺、牛血清白蛋白、二甲亚砜、甘油、乙酰胺、甜菜碱、葡聚糖、壬基酚-40和聚乙二醇。
以上文章来源于诊断科学 ，作者认真的刘博。
