HDV是一种血源性传播病原体，也是目前已知能够感染人类的最小病毒[1]。HDV最初于1977年被Rizzetto等[2]首先在HBV感染相关重症肝炎患者中发现。HDV是一种卫星病毒，其感染和传播均需要依赖HBV。因HDV感染而引起的丁型肝炎是最严重类型的病毒性肝炎。近年随着HDV检测准确性的不断提高，人们意识到HDV的流行率被严重低估，既往认为丁型肝炎发病率低的看法被彻底颠覆，HDV的精准检测也逐渐成为研究热点。
1 HDV的流行率及其危害
根据2020年的一项研究[1]估计，全球约有1200万人感染HDV。然而由于存在地区差异、人群差异、诊断方式差异，HDV的感染率被严重低估，后续有研究不断更新了HDV的感染率，2021—2023年发表的荟萃分析[3-4]报道了HDV的感染人数高达5000万~7200万。
目前已知感染HDV的高危因素包括静脉吸毒(IVDU)、高危性行为(HRSB)、HIV感染、HCV感染、高发地区人口迁徙等。因此HDV的流行率存在较大的地域及人群差异。Miao等[4]通过对1980—2019年发表的研究进行荟萃分析发现，HDV在普通人群中的流行率约为0.80%，在HBsAg阳性人群可高达13.02%，在静脉吸毒人群中的流行率为37.57%，在高危性行为人群中为17.01%。2022年Chen等[3]对1990—2021年发表的研究进行荟萃分析，发现在全球范围内，HDV/HBV/HIV三重感染者占HIV感染者的7.4%，在亚洲地区HDV有更高的流行率，尤其是在中国台湾地区，HDV/HBV/HIV三重感染率甚至高达21.4%。
HDV的流行率远超预期，HDV筛查尤其是对特殊人群的HDV检测更加应该引起重视。2017年欧洲肝病学会[5]和2016年亚太肝病学会[6]均建议对所有HBsAg阳性人群进行至少一次HDV检测。2018年美国肝病学会[7]则建议HDV的筛查不仅应在HBsAg阳性人群中进行，更应该在HDV高危人群中规律进行。目前大多数国家及地区采用HDV血清学检测(即HDV抗体)为主要检测方式。2015年世界卫生组织(WHO)慢性乙型肝炎指南[8]建议HDV活动期应根据HDV抗体滴度诊断，再通过HDV RNA检测进行最终确诊。然而根据WHO统计，目前全球只有64.9%的HDV抗体阳性患者接受HDV RNA检测，而非洲地区检测率更是远低于其他地区，仅有41.3%的HDV抗体阳性患者进行了RNA检测[1]。造成HDV检测率低及各地区检测率不同的原因，除了不同国家医疗水平存在差异，患者及医疗工作者对HDV的认识不同以外，更要归因于HDV检测方式及检测精准度存在巨大差异。
2 HDV特征及其对RNA检测的影响
HDV颗粒直径为36 nm，基因组长度约1.7 kb，可编码两种形式的丁型肝炎抗原(HDAg)，即小HDAg(S-HDAg)和大HDAg(L-HDAg)。S-HDAg是启动和维持HDV RNA复制所必需；L-HDAg可抑制HDV复制，对于病毒颗粒的组装至关重要[9]。HDV仅在肝细胞核中复制，其病毒颗粒存在缺陷，故HDV的复制依赖于HBV。作为一种包膜蛋白，HBsAg允许HDV进入肝细胞。HDV和HBV首先与肝细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合，通过牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)进入宿主细胞[10]。在发生细胞膜融合后，核糖核蛋白(RNP)复合物被释放并进一步被转运到细胞核，在细胞核内S-HDAg的mRNA被转录和翻译。进入细胞核的RNA基因组(HDV-G)作为第一次滚动环扩增的模板参与复制，所产生的反式基因组RNA(HDV-AG)聚合物被核酶切割并连接成环状单体。使用HDV-AG作为模板，合成HDV基因组RNA聚合物，并进一步裂解形成单体。细胞腺苷脱氨酶1通过调节HDV-AG来调控L-HDAg的转录和翻译[9]。S-HDAg和L-HDAg被转运到细胞核，进一步调节病毒复制或与HDV RNA结合形成RNP。含有HDV基因组RNA的RNP可以通过L-HDAg和HBsAg相互作用，输出到细胞质并包裹在HBV包膜中。HDV颗粒通过内质网-高尔基体分泌途径释放。除了依赖HBV包膜的感染方式，HDV还可以在有丝分裂期间直接在细胞之间转移可复制的HDV RNA[11]。HDV有8种基因型，同一基因型分离株之间的差异小于16%，而不同基因型分离株差异可高达40%[12]。HDV的这一特征也是导致HDV RNA检测困难的主要原因之一。
3 HDV RNA检测的临床意义
HDV感染形式有2种。(1)合并感染：HDV和HBV同时感染宿主引起急性病毒性肝炎；(2)双重感染：HBsAg携带者或慢性HBV感染者重复感染HDV导致慢性病毒性肝炎[13]。与慢性乙型肝炎相比，重叠感染HDV的患者发生肝硬化、肝功能失代偿以及肝细胞癌的风险增加2倍，在慢性乙型肝炎、肝硬化及肝细胞癌人群中，HDV的流行率分别高达26.75%、25.77%和19.80%[14]。
HDV有独特的肝内传播方式。其需要HBV编码的包膜蛋白进行传播和重新进入肝细胞，HDV也可以通过细胞分裂传播。进入肝细胞后，HDV RNA的复制中间体被模式识别受体MDA5感知，诱导IFNβ/λ分泌。IFN的分泌强烈抑制了HDV基因组细胞分裂介导的肝内病毒传播。然而IFN不能影响静止期肝细胞中的HDV RNA复制。因此在HDV的临床治疗中，IFNα/λ单药治疗有效，但很少能清除HDV。HDV感染途径及肝内复制方式的广泛研究，明确了治疗HDV的关键在于降低HDV滴度和HBsAg水平。既往HDV感染者的治疗方式以PEG-IFNα治疗为主，但是PEG-IFNα治疗效果差，只有约20%的患者出现治疗应答，且带来的诸多副作用也增加了治疗难度[15]。近年来，3类新型抗HDV药物先后进行了临床试验，分别为进入肝细胞抑制剂Bulevirtide(BLV)、戊烯化抑制剂(LNF)和HBsAg分泌抑制剂(核酸多聚体REP2139)。其中BLV已于2020年在欧洲作为治疗HDV的药物获批上市。BLV可模仿L-HBsAg的NTCP受体结合结构域，抑制HBV/HDV进入肝细胞。研究[16]表明，BLV单独用药或与IFN等联合使用均可明显降低血清中HDV的病毒载量。皮下注射BLV 24周以上，68%~72%的患者出现HDV RNA载量降低(≥2 log10 IU/mL)，但BLV不能降低HBsAg的水平。新型药物单独或与IFN的联合使用或许能为HDV患者带来治愈的曙光。
尽管HDV感染的潜在机制尚不完全清楚，但HDV负荷量可以在一定程度上影响肝脏疾病的进程。此外，目前尚无有效的HDV治疗方法。因此，亟需开发一种经济、灵敏且特异性强的HDV RNA检测方法，以监测疾病的发生发展和评价治疗效果。
4 HDV血清学检测方法及其不足
从传统意义上来说，病毒性疾病的诊断依赖于直接通过检测完整病毒或其成分(蛋白质或核酸)或通过间接血清学检查以检测病毒抗原或抗体。在HDV被发现后不久，相应的抗原/抗体检测方式被迅速研发。目前，抗体检测常被用作HDV感染的初步筛查，通过酶联免疫吸附(ELISA)或放射免疫测定检测HDAg抗体，通常检测抗-HD IgM和抗-HD IgG。在出现症状后的2~3周可检测到抗-HD IgM，在急性HDV感染2个月后消失[17]。然而，在慢性HDV感染者急性发作期间，患者的抗-HD IgM也会升高，因此检测抗-HD IgM不能明确区分急性和慢性HDV感染。急性HDV感染者的缓解期和慢性HDV感染者均出现抗-HD IgG，在病毒清除后抗体可持续存在较长时间，因此难以区分HDV的现症感染和既往感染。因此目前认为HDV RNA检测阳性是确诊HDV的金标准。检测HDV RNA的方法如聚合酶链式反应(PCR)，具有高特异性、高灵敏度的特点。除了具有极高的诊断价值，HDV RNA的病毒载量检测对于鉴别HDV基因型、确定治疗方案、追踪治疗效果等方面亦具有较高的指导意义。因此WHO推荐所有HDV抗体阳性的患者均应进行HDV RNA检测。
5 HDV RNA检测的方法及局限性
5.1 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
PCR技术是分子生物学最伟大的成就之一，由Kary B. Mullis在1983年发明，并因此获得了1993年的诺贝尔奖。RT-PCR原理是在体外模拟遗传物质的天然复制，以微量的核酸模板扩增得到大量的特定DNA片段。1985年，Randall K. Saiki等研究者首次将PCR技术用于临床疾病诊断，其使用PCR技术检测镰状细胞性贫血和β-地中海贫血。此后，PCR也被用于HDV检测。1990年，法国学者Zignego等[18]发表相关研究，确定了应用PCR技术进行HDV RNA检测、克隆和测序的可行性，证明了PCR在诊断HDV感染、快速合成HDV探针和分析病毒遗传变异方面具有重要价值。同一年，西班牙学者Madejón等[19]验证了RT-PCR检测HDV RNA在临床中的可行性。该研究通过检测梯度稀释的HDV RNA，用RT-PCR产物进行Southern印记杂交，证明RT-PCR检测比狭缝杂交技术(slot-blot hybridization)灵敏10 000倍。该团队继续将RT-PCR技术应用于临床，进行了更大数量的临床标本验证，发现慢性HDV感染过程中不同HDV复制水平以及低水平的HDV复制与ALT之间存在相关性，表明PCR技术在检测HDV复制中具有重要的应用价值[20]。越来越多的研究者将PCR应用于HDV的研究，HDV RNA检测的灵敏度和特异度不断提升，操作步骤也被逐渐优化。
5.2 实时定量逆转录PCR(RT-qPCR)
为进一步提高PCR的精准度及实现核酸定量，研发了RT-qPCR技术。RT-qPCR是指在PCR反应中加入荧光物质，通过检测荧光信号来实时判断核酸扩增情况，而后通过Ct值和标准曲线对模板RNA进行定量分析，以达到对样品进行实时定量检测的目的。根据荧光信号来源的不同，可分为荧光染料法(SYBR Green)和探针法(Taqman)。染料法成本较低，应用广泛；探针法灵敏性和特异性更强，但成本相对较高。迄今为止，RT-qPCR实验方法成熟，在核酸检测领域应用广泛，也有公司在该方法的基础上生产商品化试剂盒。尽管RT-qPCR在多种核酸检测中表现出良好的特异性和灵敏性，但是由于HDV基因型多(8种)，各基因型间的序列差异较大、二级结构牢固、GC含量和互补性高以及HDV存在高度遗传变异性，设计涵盖所有基因型的引物和探针具有极大的挑战性，因此HDV RNA检测的进展缓慢。
2004年日本学者Yamashiro等[21]首次使用RT-qPCR检测了48例HBsAg和丁型肝炎抗体阳性患者血清中的HDV RNA，不仅证明了RT-qPCR(染料法)在临床检测中应用的可能，还发现慢性肝炎和肝硬化患者血清中HDV RNA水平明显高于无症状患者，提示血清HDV RNA的病毒载量与肝病不同进程存在相关性。然而该研究设计的引物仅能检测HDV-2型和HDV-4型，且所用的临床样本量少。2005年，法国学者Le Gal等[22]进一步改进了反应体系，建立了Taqman探针法检测HDV RNA，可对所有基因型进行检测，且灵敏度高，可达到100拷贝/mL，并纳入了更多血清样本(共160例，其中包括IFN治疗前后不同时间点的76例血清标本)进行验证，研究结果显示HDV RNA的检测有助于帮助明确丁型肝炎患者治疗前、治疗中和治疗后的病毒学特征，可用于慢性感染者治疗方案管理以及HDV感染史的研究。此外RT-qPCR还可以用于大规模的前瞻性研究，以确定治疗指南和评估新药的治疗效果。在后续的数十年内，RT-qPCR技术被广泛应用于HDV检测，相关研究大量涌现，主要集中于以下5个方面。(1)用于HBV感染人群中HDV的筛查。各国家的研究者分别对韩国[23]、埃及[24]、巴基斯坦[25]、巴西[26]、澳大利亚[27]等国家及地区的HDV流行率进行评估，使人们逐渐意识到HDV的流行率被严重低估。(2)用于HDV基因型的检测。确定了不同HDV基因型的流行区域[28]，并发现HDV-3型与肝病的不良结局存在相关性[29]。通过研究大量血清或肝组织样本，证明了HDV RNA病毒载量与暴发性肝炎、肝衰竭和肝细胞癌的发生密切相关[14]。(3)用于监测IFN治疗效果及新药治疗效果的临床验证。证明了足疗程、足量使用IFN或与其他药物联用可以降低HDV病毒载量[30-31]，也证明了新型抗HDV药物BLV、LNF和核酸多聚体REP213均具有良好的治疗效果[16]。(4)用于HDV病毒谱的分析[32]和HDV全基因组测序[33]，为理解HDV重组和明确HDV感染机制提供了帮助。(5)各研究者或公司用于研发商业检测试剂盒。可实现标准化的一步实时逆转录，从临床样本中快速、精准、定量检测HDV[34]。
RT-qPCR检测是一种成熟的检测病毒核酸的方法，但在HDV的检测中存在一些缺陷。RT-qPCR检测进行RNA定量需要标准品及标准曲线。多数已发表的研究使用的阳性标准品是HDV质粒，但这并不能评估逆转录的步骤。也有研究者[35]使用体外合成的RNA作为阳性标准品，虽然该方法可以评估逆转录的步骤，但合成的RNA没有牢固的二级结构，HDV基因组的二级结构会影响HDV病毒载量的定量检测。虽然WHO已经提出了HDV RNA检测的国际标准，但检测方法仍需要进行内部优化，需与待测核酸进行共纯化、共扩增。有研究者[36]使用管家基因如β-actin和18S rRNA作为内部对照，然而，这些RNA的浓度在不同临床样本中存在较大差异。此外，质控产品的选择也会影响HDV RNA定量的准确性。理想的核酸质控产品不仅可以用于核酸检测过程的质量控制，也是评价检测程序和对比不同实验室结果的重要基础。目前，RNA病毒的质控产品多为裸露的RNA片段或完整的病毒颗粒。裸露的RNA片段很容易被环境中的RNase降解，而完整的病毒颗粒作为质控样品存在安全隐患。灭活药物虽然可以降低传染性，但病毒灭活试剂(如甲醛)会破坏病毒核酸，影响核酸的提取[37]。理想的RNA质控产品应可以长期稳定的保存RNA。装甲RNA技术可以克服RNA的不稳定性，已广泛应用于RNA病毒核酸质控产品的研究。2016年，国际上首次对血浆HDV RNA定量进行了外部质量评估。对来自全球17个国家的28个实验室进行综合分析，结果表明，由于检测技术和程序的差异以及设计的引物/探针目标区域的不同，结果具有高度异质性[38]。因此，有必要建立一个国际通用的HDV RNA定量检测体系。
5.3 逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)
LAMP是1998年由日本Eiken Chemical公司研发，该技术改善了PCR的部分不足。与PCR相比，LAMP具有以下优点：(1)反应快速、灵敏性高。可以在短时间内(＜1 h)将DNA的扩增数量增加到10亿，而PCR只能扩增到100万。(2)不依赖大型仪器或设备。LAMP可以不依赖大型仪器设备，仅需要干式加热器或水浴锅进行加热即可进行反应。(3)特异性高。LAMP的优点在于其高特异性，这是由于LAMP需要使用4~6种引物，可以识别DNA模板上8个以上的特定位点，相比之下，PCR只能识别2个位点。(4)结果判读方便。LAMP的产物可以在反应结束后立即用肉眼观察，甚至在反应进行时也可以观察到(如产生肉眼可见的白色沉淀)，而不需要任何额外的步骤。尽管LAMP已经用于多种病毒和基因检测，但其在HDV RNA检测方面仍属新方法，这与HDV RNA基因型多、引物设计困难有关。Wang等[39]建立了RT-LAMP检测方法，特异性检测HDV-1型，该方法反应体系仅需在65 ℃下反应50 min，检测下限为75 fg/μL，与常规的定性或定量PCR相比，RT-LAMP检测灵敏度提高了1 000倍，且方法特异性高，与HIV、HAV、HBV、HCV、HEV等病毒无交叉反应。虽然与PCR相比，该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，但其只针对了HDV-1型，且依赖加热设备维持反应温度，因此仍需进一步优化实验条件以实现HDV核酸即时检测。
5.4 微滴式数字PCR(ddPCR)
ddPCR是在传统定量qPCR基础上研发的新一代技术，可以对RNA进行定量。ddPCR的主要原理是利用微流控技术生成油包水乳化微滴颗粒，以每个油包水的微滴小颗粒作为反应体系，进行PCR扩增及后续荧光检测。与96孔/384孔qPCR相比，ddPCR可以增加反应体系的数量，精简操作步骤。ddPCR具有技术成熟、灵敏度高等优点，是目前应用最广泛的PCR技术之一。ddPCR的关键步骤有微滴生成、微滴操控、微滴检测。ddPCR微滴发生器可将带荧光的PCR反应体系分隔成数千甚至上万个纳升级的微滴，RNA分子在各微滴颗粒中随机分布，每个微滴颗粒都是一个独立的PCR反应体系。经PCR扩增后，分析仪对每个微滴颗粒进行检测，将荧光模拟信号数字化，有荧光信号的微滴判读为“1”，无荧光信号的微滴判读为“0”；根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，最终通过分析软件直接给出目标核酸分子的拷贝数浓度，因此不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，所以ddPCR受扩增效率的影响大幅度降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大幅度提高[40-41]。与qPCR相比，ddPCR具有以下优点：(1)ddPCR的定量不需要标准曲线；(2)ddPCR检测RNA比qPCR具有更高的灵敏性和特异性。目前ddPCR的相关方法建立及临床验证已陆续在HIV、HBV以及新冠病毒中开展[41-43]。
2022年，先后有两项研究[44-45]通过ddPCR技术建立了HDV RNA的检测方法并进行了临床验证。意大利学者Olivero等[44]检测HDV质粒及20例HDV阳性患者的血清样本，对比了RT-qPCR与ddPCR的灵敏性及特异性。结果发现在使用相同引物和探针(涵盖HDV的8种基因型)的情况下，RT-qPCR与ddPCR的灵敏性、特异性和检测下限相似。然而在研究中，ddPCR的检测范围与RT-qPCR存在差异。RT-qPCR的线性范围为1×10~1×108 IU/mL，ddPCR定量线性动态范围为1×10~1×106 IU/mL。这与ddPCR的定量方式有关，在较高的RNA浓度下(1×107和1×108 IU/mL)，反应被过量的目标分子饱和，而检测到的阴性样本量较少，无法应用泊松分布来计算起始样品中靶分子的含量。同年，我国学者Xu等[45]通过使用ddPCR检测梯度稀释的HDV全基因型的通用质粒(pMD19T)，证明所建立方法的检测下限(0.29 IU/mL vs 650.00 IU/mL)和定量检测下限(76 IU/mL vs 7 315.82 IU/mL)均优于RT-qPCR。该研究同时使用ddPCR和RT-qPCR检测44例(30例HDV感染和14例HBV感染)患者血清样本，证明ddPCR的特异性优于RT-qPCR(24/44 vs 10/44)。此外，Xu等还应用3种检测方法(ELISA、RT-qPCR及ddPCR)对728例HBV阳性患者的血清样本进行了HDV筛查，在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌和，ELISA检测的HDV抗体阳性率分别为1.1%、3.3%、2.7%和7.1%，RT-qPCR检测HDV RNA阳性率分别为0、16.67%、15.4%和20%，ddPCR检测HDV阳性率分别为0、33.33%、30.77%和60%。证明ddPCR和RT-qPCR的技术性能具有高度的可比性，并且提示在肝衰竭患者中存在更高的HDV阳性率。以上研究表明，ddPCR是一种可重复性高、不需要标准曲线以及操作简便的方法，具有广阔的临床应用前景。
6展望
越来越多的流行病学研究表明，HDV的全球患病率远高于先前的估计值。HDV感染的快速实验室诊断对于识别、监测和控制疾病传播具有重要的意义。RNA检测是诊断HDV的金标准，亦是监测HDV治疗效果的重要指标。目前，不同的HDV RNA检测方法灵敏度差异较大，主要原因在于缺乏国际统一的标准来比较不同实验室之间的检测结果。不同实验室及技术人员在HDV RNA提取、逆转录和定量等一系列操作过程中存在差别，因此需要开发新的检测方法，建立标准化程序，例如样本类型、提取方法、引物/探针设计、使用仪器和报告数据方式等，以进一步提高灵敏度和特异度，降低假阴性率，更早地识别丁型肝炎患者，及时控制HDV传播。
此外，低收入和中等收入国家或地区的医疗保健体系不完善，对HDV的认识不足，普及HDV感染的严重性，进行HDV筛查，以推动丁型肝炎的早期检测、早期诊断、早期治疗，对降低丁型肝炎的危害，减轻医疗负担有重大意义。部分HDV的高发区地处偏远，缺乏大型仪器设备和专业人员进行检测，因此研发快速、便捷、不依赖仪器设备及对检测人员要求低的HDV检测新方法，以实现HDV的即时检测，是未来的主要研发重点。
