倪晓平丨医院环境微生物标本采集与检验方法

讲者丨倪晓平（杭州市疾病预防控制中心）

整理丨雷晓婷（江苏省中医院)

审稿丨王玉兰(佛山复星禅诚医院)

来源丨2021年SIFIC全国感控与耐药感染大会

医院环境微生物采样监测是医院感染监测重要工作之一。通过环境微生物监测考核评价环境清洁与消毒质量；评价空气净化质量、环境物表的消毒效果等等；当怀疑医院感染暴发或疑似院感暴发与环境有关时，对环境卫生学的调查是不可或缺的，因此掌握正确的环境卫生学采集及检验方法非常必要，也是感控人的必修课。在2021年SIFIC全国感控与耐药感染大会上，来自杭州市疾病预防控制中心倪晓平教授的《医院环境微生物标本采集与检验方法》精彩讲座，相信大家学习后对不同标本采集与检验方法会有更清晰的认识。

一、环境微生物采集的目的

考核环境清洁与消毒质量；

评价空气净化消毒效果；

评价环境表面消毒剂消毒效果；

调查与感染暴发的关系；

环境表面在传播病原菌作用的研究；

工程控制--表面材料的抗菌作用的研究。

环境微生物采集的目的不同，医院感染环境微生物检测的策略也不同。

二、环境微生物采集方法

（一）不同采样目的所遵循的规范要求不同

以考核清洁消毒质量为目的时，应按照既有规范的要求采样，如采样面积、采样工具（使用棉签涂抹法）等应符合规范要求。培养介质、实验条件、评价标准也应严格遵守规范，并做好阴性、阳性对照，进行微生物检测质量控制。

水标本尽量用蓝口瓶采集。如使用带软塞的试管，应配合酒精灯。采样器具放置在采样箱内携带转运，有条件的，试管架和其它采样器具分别放置。

必要时采样后的试管置于冰包内，以免检验前增菌。采样时采取必要的个人防护、做手卫生。

根据GB-15982《医院消毒卫生标准》，怀疑医院感染暴发或疑似暴发与医院环境有关时，应对各类环境空气、物体表面、工作人员手等进行目标微生物检测。如医务人员手、医疗器械、治疗用水、防护用品、消毒剂、消毒器械、污水的采样。

以调查环境与感染暴发的关系为目的采样时，可有多种方法：如海绵棒涂抹法（可以做大面积1m2采样）、平皿接触法（RODAC平皿）、载玻片接触法、薄膜粘贴法（用于可吸水的软质表面，如棉被、枕头、工作服等）。选用不同的采样工具，不限制采样面积，以尽可能捕捉到病原体。培养介质可以用选择性培养基，也可以增菌。

（二）目标细菌监测

杭州疾控中心曾对医院自测阴性的环境采样，结果发现：某市级医院ICU 环境表面MRSA阳性率100%，某省级医院NICU的环境MRSA阳性率50%。阳性率高的原因是，CDC使用了高分子材料采样拭子和MRSA选择性培养基。

高分子纤维拭子对环境表面细菌的吸附能力优于普通棉签，而针对特定病原菌的选择性培养基，较普通营养琼脂，更容易筛选出环境中一些非优势生长的致病菌。选择性培养基可选国产、进口产品，或自行配置。实验室要注意实验室生物安全。

疑似院感暴发调查：杭州CDC曾参与某医院ICU病房疑似医院感染暴发调查，采集环境标本121份，有菌落生长的环境表面有113份（93.4%），挑取750个菌落进行鉴定，鉴定出1种细菌的表面有30处（24.8%），最多的一处表面鉴定出8种细菌。而医院采样未见明显结果。时间成本上看，普通PCR培养需要7天以上，耗材3.5万元，高于MS。

（三）采样时机的选择

采样时机也很重要。采样时应了解，环境表面最后一次清洁消毒是什么时候？是清洁前还是清洁后？清洁后多长时间？

日常监测，采样时机选择清洁后；如果做流行病学调查，应选择清洁前，还可以现场接种或进行增菌。

（四）日常监测注意事项

规范采样与实验；

针对性配制中和剂；

不得增菌、富集手段；

倾注培养、采样液剂量；

培养基，培养温度与时间；

微生物检测质量控制：

（1）培养基考核；

（2）阴、阳性对照；

（3）采样液富集（离心、膜滤、增菌等）。

（五）空气采样方法

空气采样方法有两种：被动采样和主动采样。

被动采样：自然沉降。基于采样区域空气中的颗粒物（细菌、真菌孢子）在重力作用下的自然沉降而将其捕获。对于粒径小、长时间悬浮空气中的病原体，可能无法获取。如，真菌孢子直径1~2微米，每小时沉降仅0.1~0.4米，被动采样捕捉到的概率就很小。

主动采样：动力抽气。基于动力风机抽气收集采样区域空气中颗粒物（细菌、真菌孢子）的采样方法。可决定采多大体积的空气。如单极空气采样器，仪器抽吸空气通过培养介质表面，通过控制采样时间调整采集样本的体积，可以在疑似污染源周围使用。

两级气溶胶采样器能将不同粒径颗粒物分层捕捉，获得不同大小颗粒物的阳性率。六级Andersen采样器，可对不同粒径的颗粒物进行捕获。

口罩采样：有人对口罩采样进行研究，感染患者佩戴含有滤膜的口罩，通过口罩滤过面来收集空气中的病原体。这种方法能连续收集标本，据报道，口罩标本中结核杆菌检出率（86%）明显高于普通痰标本（21%），作者认为口罩采样是连续收集标本，而痰标本除标本质量外，更关键的是某个“点”时间的采样。

（六）水源性微生物检测方法

检测目的：医疗机构用水主要是以城市自来水为基础，因水源污染造成的医院感染暴发已不鲜见，使用污染的水冲洗医疗器械，或用其洗手后进行侵入性操作，都可能增加感染风险。1990年至2012年文献报道医疗机构水源性医院感染暴发事件多达125起，因此，对水源性微生物检测非常重要。

微生物特点：

（1）微生物主要由碳元素构成，含量占菌体干物质质量的一半，其生长主要需要C、N、S等物质。微生物生长与繁殖所需要的环境温度有很大区别，如可以分为低温（22℃）、中温（36℃）、耐热（44℃）生长。

（2）按照细菌生长营养获取的方式，分为自养菌和异养菌。通常我们使用的培养温度在36℃左右（温度接近人体温度），如有菌生长，更多考虑病原菌来自人体。如果44℃条件培养阳性，应考虑为土壤环境细菌。如果22℃条件培养阳性，应考虑为水源环境细菌。

监测标准：

（1）目前，国际上对医疗机构用水的微生物监测方法缺乏统一标准。医疗机构用水微生物检测，执行GB/T 5750.12-2006《生活饮用水检验方法微生物指标》规定的菌落数检测方法，即水样在营养琼脂上，有氧条件下36℃±1℃培养48h后，所得的细菌菌落总数，标准为<100CUF/ml。检测的接种技术指定为倾注培养法。

（2）YY 0572-2015《血液透析及相关治疗用水》已开始关注环境污染菌的检测，要求采用常规的微生物检测方法获得细菌总数，首选薄膜过滤法，但不接受接种环法。可以参考采用《中华人民共和国药典（二部）》（2010年版）中规定的方法，或培养基选用胰化蛋白胨葡萄糖培养基（TGEA）、R2A或其它确认能提供相同结果的培养基，不能使用血琼脂培养基和巧克力琼脂培养基，推荐17℃~23℃、168h（7d），针对环境菌的培养条件进行培养。

（3）我国和欧洲饮用水微生物检测标准比较，两者饮用水参照限值标准不同，美国EPA标准是<500CFU/ml，我国标准是<100CFU/ml。主要区别在于我国用营养琼脂（PCA），37℃培养2天，考虑的是检出人体污染菌；而欧洲标准使用R2A培养基，25℃培养7天，更多考虑环境污染菌。

（4）R2A培养基监测优势：

R2A培养基有低营养，碳源丰富的特点；与营养琼脂相比，更容易培养出环境细菌。

有研究对13家制药企业生产使用的制药用水卫生质量检测方法进行对比，结果显示，采用中国药典规定的检测技术，营养琼脂培养基，30~35℃，3d与玫瑰红钠琼脂培养基，23~28℃，5d，结果仅检出1家企业制药用水细菌超标。而采用欧洲药典的R2A培养基，培养条件30~35℃，5d，则有5家企业的制药用水细菌超标。

低营养（Low nutrition），但碳源丰富；低培养温度（Low temperature），延长培养时间（Long time），被称为水源菌“3L”微生物检测策略。这种策略更适合城市饮用水中污染菌的培养。但是，如前所述，日常监测仍然按照国家标准来采集和检测饮用水，36℃，48h，营养琼脂培养。

水源性微生物采样监测步骤：

日常监测时，可以先放水，再取样。如口腔科手机水先放水1min，漱口水先放水3杯，再采样50ml。

流调时，可以计算每段管路中水的体积，判断采到的水是哪一段，进行分段留取水标本。

使用蓝口瓶采样，则将水样过滤；无菌操作下将滤膜接种于平皿表面进行培养。

取1ml水样，加入倾注培养基；倾注培养基的缺点是细菌生长于琼脂中，无法进行细菌鉴定。涂抹法培养的菌落在培养基表面便于鉴定。涂抹法至少应250μL*4块平皿，合计总数。

感悟

倪晓平教授通过详细讲解环境微生物标本采集与检测方法，让我们更加认识和领悟到：微生物检测是考核院感的金标准。作为感控人关注日常消毒质量的考核要执行国家标准；减少常规环境表面细菌污染的监测；在感染暴发流调时采用一切可用的手段；重视采样用工具与培养技术的选择一样重要；分子实验的介入以提升循证等级。

一句话：重视与发展微生物技术，刻不容缓！

图文：王小虾