新冠病毒变异株在干燥拭子存储后的存活与检测

来源：南非约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学健康科学学院生物医学结核病研究卓越中心，科学与创新部/国家研究基金会，国家健康实验室服务。

COVID-19自2019年严重急性呼吸综合症冠状病毒2型（SARS-CoV-2）大流行开始以来，已导致近5.98亿人感染和超过646万人死亡。大流行的迅速爆发，加上病毒变种的出现，严重削弱了许多卫生系统，特别是在应对大量诊断负荷的能力方面。诊断试剂盒和能力的短缺迫使实验室储存临床样本，导致了巨大的积压，这对诊断结果的影响尚未完全了解。在此，我们研究了在7天内储存SARS-CoV-2接种的干拭子对四种病毒株的检测和活力的影响。通过qRT-PCR检测的病毒载量在此期间对所有测试的病毒载量显示没有显著降解。相反，通过组织培养感染剂量（TCID）测定，病毒活力减少了约2个对数，在干拭子上经过7天后检测到1-3个对数的活病毒。当用102个病毒拷贝的Omicron变种涂覆拭子时，在4°C或室温下储存24小时后未检测到活病毒。然而，在7天内没有丧失PCR信号。所有四种病毒株在Vero E6细胞中培养时显示出相似的生长动力学和存活能力。我们的数据提供了关于临床环境中储存拭子上SARS-CoV-2活力的信息，对诊断结果的获取和实验室处理协议具有重要意义。高病毒载量的SARS-CoV-2株在拭子上存活7天可能会影响公共卫生和诊断实验室的生物安全实践。

引言
冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸综合症冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的，首次报告于2019年12月31日在中国湖北省武汉市（Zhu et al., 2020）。最初，SARS-CoV-2感染的患者表现出不同程度的疾病严重性，从无症状感染（1%）到严重呼吸疾病（20%）和致死率（2-3%）（Bai et al., 2020; Chan et al., 2020; Wu and Mcgoogan, 2020）。几周内，COVID-19传播至全球，导致世界卫生组织（WHO）宣布其为全球大流行（WHO, 2020）。SARS-CoV-2主要通过呼吸道分泌物或飞沫的密切接触传播（WHO, 2020）。然而，有证据表明通过接触病毒污染的表面和手也可以间接传播（Marques and Domingo, 2021）。SARS-CoV-2能够在不同表面上存活较长时间，存活时间从几天到几个月不等，具体取决于环境温度（Sun et al., 2020; Sun et al., 2022）。

疾病的快速传播和进展要求进行高通量检测，以管理和控制传播。这导致了样本检测的积压，特别是在资源有限的环境中，因财务资源、人力和检测试剂盒的获取不均而受到影响。因此，临床拭子样本不得不在检测前存储较长时间。在某些情况下，特别是在公共卫生检测设施中，储存的标本被销毁，以试图在最佳利用可用检测试剂盒和因长期储存而获得阴性结果之间取得平衡。这迫使实验室和制造商探索替代的样本收集和运输方式（Rogers et al., 2020）。为了调查储存的诊断影响，最近的一项研究显示，SARS-CoV-2鼻咽拭子的延长（21天）储存不会对三种不同分子平台的基因组材料回收产生负面影响（Skalina et al., 2022）。另一项研究表明，干拭子的运输后再水合，使用三种不同的介质（UTM、VTM和生理盐水），与在运输介质中收集的拭子相比，病毒RNA的回收没有差异（Parikh et al., 2021）。虽然这些数据表明储存的干拭子保留了诊断价值，但它们并未评估病毒的可培养性。先前的研究表明，临床标本中病毒拷贝数与活力之间存在强相关性，但没有报告时间数据（Huang et al., 2020）。

在此，我们研究了干拭子储存7天对不同SARS-CoV-2病毒株的回收和活力的影响。我们还调查了变种在干拭子上的生存情况是否存在差异。我们的数据表明，储存7天并未影响检测基因组材料的能力。然而，在同一期间，病毒的活力下降了2个对数，残余活病毒的检测水平高达3个对数。

材料与方法
所有方法均按照维特沃特斯兰德大学生物安全委员会批准的相关指南和规定进行（批准编号：20200502Lab）。所有实验均在南非农业、林业和渔业部注册的生物安全三级实验室中进行（注册编号：39.2/NHLS-20/010）。

猴子 Vero E6 细胞系的培养条件

贴壁的猴子 Vero E6 细胞在完全的 DMEM 中培养和维持，该培养基通过将 45 毫升含 L-谷氨酰胺的杜尔贝克改良鹰培养基（DMEM）与 5 毫升胎牛血清（FBS）和 50 μg/ml 的庆大霉素混合制备而成。将来自液氮的 Vero E6 细胞的冷冻小瓶迅速解冻（约 2 分钟），并在 37°C 的水浴中轻轻摇动。解冻后的细胞转移到一个含有 9.0 毫升完全 DMEM 的 50 毫升离心管中，以 125 x g 的速度离心 5 分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于残余培养基中，并加入到一个含有 10 毫升预热完全 DMEM 的 25 cm²（T25）培养瓶中。细胞在 37°C、5% CO₂ 的条件下培养，监测细胞生长，直到细胞达到 70-80% 的融合度。当需要时，每 2 到 3 天更换一次培养基，通过丢弃培养瓶中的旧培养基并替换为新鲜的完全 DMEM。当细胞达到所需的融合度（>80%）时，去除旧培养基，用 5 毫升 TripleX（Gibco）处理 10-15 分钟（37°C）。从培养瓶表面脱落的细胞平均分配到两个 75 cm²（T75）培养瓶中，并按照上述方法继续培养。根据实验要求以这种方式扩增细胞。

SARS-CoV-2 病毒滴度的扩增

来自南非的四种 SARS-CoV-2 毒株的扩增，分别为武汉毒株（由斯坦陵布什大学提供的病毒上清液）和从国家卫生实验室及南非传染病国家研究所获得的残余去标识临床拭子中分离的 Beta、Delta 和 Omicron 毒株（伦理审查编号 M1911201）。将冷冻样本的运输介质解冻后，通过 0.45 μM 过滤器过滤，然后将 250 μl 的相应上清液接种到预先接种了 1.2 x 10^6 Vero E6 细胞的 24 孔微孔板的每个孔中，感染 1 小时。感染后，每个孔中加入 250 μl 完全 DMEM，并在 CO₂ 培养箱中培养 3-4 天。每日监测细胞的细胞病变效应（CPE），当大约 80% 的细胞从培养孔底部脱落时，收集上清液。从每个样本中取出 150 μl 上清液进行 RNA 提取，其余上清液在 BSL3 实验室的 -80°C 冷冻保存。使用实时 RT-qPCR 定量病毒拷贝数，拷贝数达到 10^6 的样本通过将 250 μl 的相应冷冻病毒样本接种到接种了 10 ml、3 x 10^6 Vero E6 细胞的 T75 培养瓶中进行扩增。3-4 天后，当 80% 的细胞显示 CPE 时，将培养基以 2500 x g 的速度在台式离心机中离心 15 分钟。将上清液转移到一个新的 50 毫升管中，并分装 1 ml 的样本在 -80°C 冷冻保存。对于每种变异株，至少纯化了三个或更多的分离物，除了 Beta 变异株，54 个筛选的分离物中仅有一个显示出复制能力。

生长动力学

本研究使用了武汉、Beta、Delta 和 Omicron（BA.1）毒株。使用中位组织培养感染剂量（TCID）法确定细胞活性。Vero E6 细胞以 1.2 x 10^5（2.5 ml）的浓度在 6 孔微孔板中以三重重复接种，每种毒株各自接种，培养过夜于 37°C。解冻的病毒样本被解冻后，500 μl 用于感染三重孔中的细胞。感染 1 小时后，每个孔中加入 2.5 ml 完全 DMEM。通过 TCID 法在 0、24、48 和 72 小时监测病毒的生长。在每个时间点，通过 qRT-PCR 评估病毒载量，并报告为每 20 µl 反应的拷贝数。为此，将 150 μl 上清液在 70°C 处理 5 分钟，与 600 μl 裂解缓冲液混合，然后分析 300 μl 的上清液以实时 TCID 法评估病毒的复制能力。

拭子的病毒涂覆

将各自的病毒株 aliquots（约 10^5 病毒拷贝，按 qRT-PCR 测定）解冻并在 DMEM 中稀释十倍（10^5、10^4、10^3 和 10^2）。五个 Copan eSwabs（Copan Italia S.p.A）分别浸入这些不同稀释液中 10 秒，以实现高、中、低和非常低的病毒载量。对于 Delta 变异株，这允许在拭子上接种约 10^4 和 10^3 pfu/ml。对于 Omicron 变异株，此过程允许在拭子上接种 10^4、10^3 和 10^2 pfu/ml。接种后的拭子放入 15 毫升的 Falcon 管中，并在 4°C 下储存 0 小时、24 小时、48 小时、72 小时或 7 天。对于以 10^2 pfu/ml 接种的 Omicron 变异株，拭子也在室温下储存。

感染 Vero E6 细胞前从干拭子中回收病毒

病毒回收仅在 Delta 和 Omicron 变异株中进行评估，因为这些是在研究期间流行的变异株。对这两个变异株的每种稀释液中各取一个拭子，立即（时间 0）评估，然后在 24 小时、48 小时、72 小时和 7 天后评估病毒的复制能力。将拭子放入 500 μl 不含 FCS 的 DMEM 中，放入 2 ml O 型环管中混合约 30 秒，以释放拭子上的病毒。取出 150 μl 的培养基进行 qRT-PCR 分析，300 μl 用于 TCID 法，如下所述。

TCID 法确定 SARS-CoV-2 的活性

将干拭子重悬的培养基稀释 10 倍至 10^-5，每个稀释液中取 250 μl 用于感染前一天接种的 Vero E6 细胞（1 x 10^5 细胞/ml）在 24 孔培养板中。感染在 37°C 下进行 1 小时，然后在 250 μl 的接种液上添加 250 μl 覆盖培养基（含 4% FCS 和 2 ml（3%）琼脂糖的 DMEM），并在 37°C 下培养 3 天。在每个时间点，包含病毒分离物的系列稀释液作为阳性对照，未感染的孔（仅培养基）作为阴性对照。感染 3 天后，用 500 μl 的 8% 甲醛固定覆盖培养基上的清晰区（斑块）20 分钟。去除上清液，用 250 μl 的 1% 含晶体紫的溶液染色 5 分钟。去除晶体紫后，用 500 μl PBS 冲洗孔。计算更稀稀释液中的斑块数，并将斑块形成单位（pfu/ml）计算为斑块数 × 稀释因子/0.25。

总 RNA 提取和 cDNA 合成

所有 RNA 提取均使用 NucleoSpin Viral RNA 试剂盒（Macherey-Nagel）按照制造商的说明进行。简而言之，将含有病毒颗粒的 150 µl 上清液与 600 µl RAV1 裂解缓冲液（含 45-60% 硫氰酸胍）混合，并在 BSL3 实验室中在 70°C 热处理 5 分钟。样品随后在 BSL2 条件下处理。从 50 µl 中取 5 微升的总 RNA，混合 2 微升反向引物混合物（E 基因特异性引物，最终浓度为 2.5 µM，6 微升水）。引物与 RNA 结合（94°C 1.5 分钟，65°C 3 分钟，57°C 3 分钟），然后迅速冷却至冰上。使用 Superscript IV（Thermofisher）合成互补 DNA（cDNA），按照制造商的说明进行。

qPCR 分析

所有 qPCR 分析均使用 Brilliant III Ultra-Fast SYBR Master Mixes（Agilent, Diagnostech）在 Bio-Rad CFX96 实时 PCR 机器（C1000 touch 热循环仪）上进行。通过创建已知浓度的质粒 DNA（BN2）稀释系列（10^7 至 10^1 拷贝/反应）为 E 基因引物组生成标准曲线。每个样品（BN2 标准、cDNA 样品和无模板对照 [NTC]）的 1 微升在 20 微升体积中进行评估，使用优化的热循环程序（98°C 2 分钟，40 个循环：98°C 5 秒，59°C 5 秒，72°C 5 秒）。完成 qPCR 后，通过熔曲线分析确定扩增特异性。每个反应均进行双重重复。

SARS-CoV-2菌株的测序

总RNA被送往Inqaba Biotechnical Industries (Pty) Ltd，一家商业NGS服务提供商进行分析和变异菌株确认。简而言之，RNA使用NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 FSLibrary制备试剂盒转化为cDNA。根据制造商的说明，cDNA使用VarSkip短表达协议（NEB）进行扩增。每个样本产生500MB的数据（2x 150 bp）。随后，序列数据（FASTA文件）被上传至https://clades.nextstrain.org/以确定变异。与每个变异菌株相关的特征突变通过https://covariants.org进行确认。基因组序列数据可在BioProject编号PRJNA882477下获取。

结果

SARS-CoV-2菌株的筛选、培养和确认

来自斯坦陵布什大学的同事提供了武汉株的病毒培养上清液。Beta、Delta和Omicron变异株的SARS-CoV-2是从残余患者样本中分离得到的。在30-60个样本中筛选出变异株，除了Beta株仅回收了一个分离株外，Delta和Omicron（BA.1）分别获得了三个独立的分离株。这四个SARS-CoV-2分离株（武汉株、Beta株、Delta株和Omicron株）进行了测序，以确认谱系特征突变（见表2和图1A）。

临床患者样本在Vero E6细胞中筛选，以分离出三种SARS-CoV-2变异株。通过qRT-PCR确认菌株，并对阳性样本进行纯化，以生成每种病毒菌株的储备。 (A) 每个菌株的基因组进行了测序，并使用https://clades.nextstrain.org/确认菌株类型。通过https://auspice.us/绘制了将这些分离株（彩色点）与2275个其他基因组序列（由软件自动选择）进行分类的系统发育树。克隆类型由粗体彩色线表示——野生型（20A、C和D，灰色）、Beta（紫色）、Delta（蓝色和绿色）和Omicron（红色）。 (B) 使用中位组织培养感染剂量（TCID）测定了分离株1（图S1）对每种菌株的活性。将以1 x 10^5细胞/ml接种的Vero E6细胞在24小时后用各自病毒菌株的10倍稀释液感染。细胞在72小时孵育后被染色，以评估斑块形成作为病毒活性的指标。所有四种菌株在Vero E6细胞单层中均显示出复制能力，表明存在斑块形成。

所有菌株通过qRT-PCR标准化为10^5-10^6个基因组当量（见图S1）。使用来自武汉、Delta和Omicron的三个分离株，以及可用的Beta分离株的三个重复样本，评估了其复制能力，采用了TCID测定法（见图1B）。武汉和Beta菌株在所有稀释度下显示出相似的斑块形成能力。Delta变异株在Vero E6细胞中似乎形成了更大的斑块，这种效应可能是由于起始病毒材料浓度较高（见图S1）。尽管Omicron变异株的起始病毒材料浓度与武汉和Beta菌株相似，但其产生的斑块较少。

SARS-CoV-2病毒的生长动力学
在Vero E6细胞中，监测了武汉、Delta和Omicron菌株的三个不同分离株以及一个Beta菌株的一个分离株（重复三次）的生长情况，持续三天，通过qRT-PCR和TCID测定法进行监测。所有菌株的所有分离株在72小时内显示出可比的生长（图2A–D）。所有菌株在感染72小时后均产生约6 log pfu/ml的病毒滴度，生长速率相似（图2E）。在相同的生长时间点，超natants通过qRT-PCR定量测定病毒RNA。RNA拷贝数在72小时的生长期间从每个反应102拷贝增加到106拷贝。通过qRT-PCR和TCID测定法测量的生长速率在不同分离株之间没有差异。

在接种了1 x 10^5个细胞/ml的Vero E6细胞后，经过24小时感染了三种不同的武汉株分离株（A）、Beta变异株（B）、Delta变异株（C）和Omicron变异株（D）。每种变异株的三个单独分离株在面板（A-D）中以从深到浅的颜色阴影表示（武汉株为蓝色；Beta变异株为绿色；Delta变异株为橙色；Omicron变异株为紫色）。通过TCID测定法监测病毒在72小时内的生长情况。（E）四种SARS-CoV-2菌株的生长比较，显示为三次生物重复的平均值，结果显示复制适应性没有差异。（F）在相同时间点，通过qRT-PCR定量检测针对E基因的病毒拷贝数来监测生长情况。菌株的颜色与面板（E）中使用的阴影一致。基因表达为三次生物重复的平均值，误差条表示均值的标准误差。

从干燥拭子中存储后SARS-CoV-2的病毒定量

接下来，我们评估了存储干燥拭子中病毒材料的保留和恢复情况及其活性。在本研究进行时，Delta和Omicron变异株是全球主要流行的毒株，由于四种毒株的生长动力学相似，我们选择进一步测试这两种变异株。我们用经过校准的病毒量涂覆了五个Copan拭子，然后在4°C下孵育0小时、24小时、48小时、72小时和7天（图3A）。在每个时间点上，涂覆104 pfu/ml病毒的拭子中可恢复的具有复制能力的病毒在Delta和Omicron变异株之间是相同的（图3B）。Delta和Omicron变异株在存储48小时后显示出活性有轻微下降。存储72小时后，病毒活性下降了1个对数，存储7天后活性下降了2个对数（图3B）。相比之下，通过qRT-PCR评估的病毒RNA检测在同一时间段内对这两种变异株保持稳定（图3B）。为了研究病毒载量如何影响活性，我们用高和低数量的病毒涂覆拭子。当拭子涂覆105 pfu/ml的Delta变异株（图3C）和103 pfu/ml的Omicron变异株（图3D）时，观察到了病毒活性和RNA检测的相同趋势。在所有情况下，存储7天后拭子上仍然存在残余的具有复制能力的病毒。因此，我们的数据表明，干燥拭子可以在4°C下存储至少7天，而不会导致病毒RNA的降解，但活性损失为2-4个对数。接下来，我们希望评估在非常低病毒载量下接种的拭子的病毒活性和PCR信号，并在室温和4°C下存储，以重现临床标本的类似情况。为此，涂覆了102 pfu/ml的Omicron变异株在拭子上，随后进行存储和活性及PCR信号的评估。在这两种存储条件下，24小时后未检测到活病毒。尽管如此，7天后PCR信号没有丢失。

讨论

随着新冠病毒（COVID-19）大流行的迅速爆发，缺乏即时的治疗和疫苗选择，疫情在短时间内迅速达到全球灾难性水平。这导致诊断实验室因大规模检测而不堪重负。变异株的出现进一步加剧了这种情况，因为一些诊断测试需要重新评估其敏感性和特异性。据我们所知，目前尚无研究评估这些变异株在干燥拭子上的存活和恢复情况。我们证明来自武汉、Beta、Delta和Omicron谱系的分离株显示出没有差异的生长动力学。在相似的初始病毒载量下，所有四种毒株均能感染Vero E6细胞并以相似的速度形成斑块。此外，对72小时内生长动力学的评估显示没有与变异株相关的差异，这表明SARS-CoV-2基因组中的突变不会影响在Vero E6细胞中的复制能力。

为了有效管理和控制每一波感染，及时检测临床标本也是必要的。由于检测试剂盒和液体运输介质的严重短缺，拭子被干收集并在检测前进行水合。这通常导致临床样本的长期存储，迫使实验室和制造商寻找新的诊断方法。在资源受限、检测量大的实验室中，优先处理存储拭子的检测变得困难，结果是样本常常在没有诊断评估的情况下被丢弃。尽管最近的研究表明成功从长期存储的拭子中恢复RNA，但存储对各种SARS-CoV-2变异株的存活和复制能力的影响尚不清楚（Parikh等，2021；Skalina等，2022）。我们评估了从长期存储的拭子中恢复的Delta和Omicron变异株的病毒RNA完整性和活性。这些是在本研究时占主导地位的流行株。尽管这两种变异株在存储拭子上仍然具有活性，但在7天后生长下降了2-4个对数。在低病毒载量下，24小时后未检测到活病毒。在同一时期，所有拭子的RNA通过qRT-PCR评估未出现降解。总体而言，我们的数据表明，SARS-CoV-2能够在干燥拭子上存活至少一周而不丧失RNA完整性，这表明积压样本可以进行有意义的诊断检测。使用干拭子标本具有重要的安全益处，因为它消除了在高流量患者护理区域产生气溶胶和感染性废物的潜在风险。本研究的结果对未来与RNA病毒相关的大流行的临床样本检测管理和控制具有重要意义。本研究的一个局限性是使用了已知浓度的SARS-CoV-2毒株的纯化培养物。因此，直接从鼻咽收集的标本的稳定性可能会因初始病毒载量和感染点的不同而产生变异。最后，干拭子上在7天后仍存在的残余、复制能力强的病毒，尤其是在高病毒载量的情况下，可能对理解SARS-CoV-2在环境中的存活具有重要意义。

数据可用性声明
本研究中呈现的数据已存放于SARS-CoV-2变异体全基因组序列库，访问号为PRJNA882477（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA882477）。

伦理声明
涉及人类参与者的研究已获得威特沃特斯兰大学的机构生物安全委员会的审查和批准。患者/参与者已提供书面知情同意以参与本研究。

作者贡献
BK和BG构思了研究的整体概念。BG和CE执行了研究的实验室部分。BK和BG撰写了手稿的初稿。所有作者均对文章进行了贡献并批准提交的版本。

资金支持
本工作得到了南非国家研究基金会（BK和CE）和南非医学研究委员会（BK、BG和CE）以及国家卫生实验室服务研究信托基金（BG）的资助支持。样本/培养物的研究和开发选择、分型和检测得到了比尔和梅琳达·盖茨基金会通过实验室工程加速诊断投资（拨款号OPP1171455）提供的资金支持。

致谢
我们由衷感谢南非国家卫生实验室服务（Dr. Lucia Hans、Dr. Kim Steegen、Dr. Pedro Da Silva）和国家传染病研究所（Dr. Mignon Du Plessis、Mrs. Linda De Gouveia、Mr. Siyanda Dlamini）提供的SARS-CoV-2残余患者样本，以及斯泰伦博斯大学的Prof. Wolfgang Preiser和Dr. Tasnim Suliman提供的病毒培养上清液、Vero E6细胞株，并感谢他们在病毒的生长和收获方面的指导。我们还要感谢Prof. Wendy Stevens、Prof. Lesley Scott、Dr. Riffat Munir和Mrs. Lara Noble在样本选择、分型和培养样本检测方面的贡献，以及Mr. Graeme Dor提供的标准护理循环阈值结果。

利益冲突
作者声明研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

出版者声明
本文中表达的所有观点仅代表作者的观点，并不一定代表其所属组织或出版商、编辑和审稿人的观点。本文中可能评估的任何产品或其制造商可能提出的任何声明，并不保证或得到出版商的认可。

补充材料
本文章的补充材料可以在以下链接找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.1031775/full#supplementary-material

参考文献
Bai, Y., Yao, L., Wei, T., Tian, F., Jin, D. Y., Chen, L., et al. (2020). Presumed asymptomatic carrier transmission of COVID-19. JAMA 323, 1406–1407. doi: 10.1001/jama.2020.2565