妊娠和早产期间阴道微生物组宿主相互作用的直接拭子代谢谱分析
IF:16.6 Nature communications 2021.10 帝国医学院 英国
研究概述
在怀孕期间，由上阴道感染引起的妊娠组织(如宫颈、胎膜)炎症被认为是导致早产的重要因素，并且是5岁以下儿童死亡的主要原因。本研究收集了两个独立妊娠孕妇队列的宫颈阴道分泌物，使用解吸电喷雾电离质谱法(DESI-MS)直接在棉签样本上检测代谢谱。通过整合队列样本的16s扩增子测序和免疫谱数据，作者发现特定的代谢组特征可以用于预测阴道微生物群的组成和宿主的炎症状态，从而揭示阴道微生态失衡和先天免疫激活与早产有关。
研究背景
阴道微生物组是生殖道病理生理学研究的关键介质。健康人群的阴道微生物组中乳酸杆菌物种占据优势，在营养物质有限的情况下，乳酸杆菌可通过其优势生长竞争性地消耗潜在致害菌的营养素，这种竞争有限营养素的能力是决定菌群分布的重要因素，因此乳酸菌种类的减少和其他微生物多样性的增加是细菌性阴道病（Bacterial Vaginosis，BV）的特征，产生次优阴道微生物群组成(VMC)。VMC与宿主先天免疫反应和炎症的激活受共同机制途径调节，而乳杆菌等益生菌属的存在可以改变宫颈阴道黏膜的代谢环境而抑制这一过程的发生。
宫颈环扎术是一种手术，用于加强因宫颈缩短而有早产风险女性的子宫颈。最新报道表明，宫颈环扎术如若使用辫状而不是单丝环扎材料进行，可能诱发阴道细菌性生态失调、炎症激活和宫颈过早成熟，这与早产风险增加有关。高度多样性及BV相关的阴道微生物群也与HPV感染、宫颈发育不良、受精失败、流产和早产有关。在妊娠期间，产妇阴道感染引起的妊娠组织(如宫颈、胎膜)炎症将会过早激活胎儿的免疫系统，最终可能导致胎儿早产。
因此，需要一种方便、快捷的检测手段去取代常规检测样品制备的复杂程序，以便快速对女性阴道微生物群进行检测和潜在的早产干预治疗。
研究方法
在本研究中，作者共招募了两个独立的妇女队列（图1A)，两个队列中的妇女年龄、BMI、妊娠状态和种族相似。队列一（VMET）共招募了160名女性，在她们的整个妊娠期间进行纵向采集（共455个拭子样本）。这些样本采用解吸电喷雾电离质谱法（DESI-MS）进行代谢分析，并使用另外五种液相色谱-质谱（LC-MS)进行跨平台比较。队列二（VMET2）共招募205名女性，在与队列一类似的时间点纵向采样(共573个拭子样本)，样本除经DESI-MS代谢特征分析外，还有部分用于免疫谱研究。此外，两个队列的样本均进行了16s扩增子测序分析。
作者使用了多种预测模型来评估妊娠期阴道棉签拭子样本中代谢产物是否可用于监测早产和妊娠期间使用的临床干预（例如宫颈环扎术）相关的阴道微生物组成变化和宿主炎症反应。
图1：使用DESI-MS代谢谱能可靠的预测宫颈阴道液微生物组组成
研究结果
1. 通过拭子DESI-MS预测VMC
针对VMET和VMET2两个队列样本，使用16s扩增子测序，并基于OUT的Jensen-Shannon距离矩阵进行Ward's Linkage层次聚类分析，将阴道样本分为11个不同的组（图2）。
图2：VMET和VMET2研究中16S rRNA基因测序数据的分层聚类分析图
使用Silhouette评分进行评估，最终在两个队列中共确定了六个主要的菌群类型（community state types，CSTs）：（1）CST I（L. crispatus）；（2）CST II （L. gasseri）；（3）CST III(L. iners)；（4）CST IV(Gardnerella vaginalis)；（5）CST V(L. jensenii)；（6）CST VII(other Lactobacillus spp.)（图3），而CST VI (Bifidobacterium breve) 则为VMET2特有的菌群类型。在属的水平上，将七个菌群类型分成两个群，CST I、II、III、V、VII归属于乳酸菌优势群（Lactobacillus-dominated，LDOM），而CST IV、VI归属于乳酸菌劣势群（Lactobacillus-depleted , LDEPL）。使用线性混合效应模型，在对两个患者队列的独立分析中，发现在DESI-MS的负离子和正离子模式下确定的总共113种代谢物特征在LDOM和乳酸菌劣势LDEPL两个群之间有显著区别（图3）。
图3：VMET和VMET2研究中6种主要的主要的微生物群落状态类型
作者使用随机森林分类法和ROC-curve分析，对DESI-MS预测VMC的性能进行评估。在负离子极性模式(VMET/VMET2; AUC 94.1/90.6; sensitivity: 62.0/54.5; specificity: 97.8/96.4)下，患者队列中对LDOM和LDEPL的预测结果显著，对几种主要的阴道CST（CSTI，III和IV）之间的区分明显，表明可以通过直接拭子的DESI-MS法检测来实现对VMC的预测。
图4：不同阴道微生物群组成之间DESI-MS分类性能比较
2. 阴道共生菌和致病菌分离株的体外 DESI-MS 分析
接下来，作者对阴道菌群中CST主要成员的细菌物种进行培养并鉴定了培养分离物(n = 25)，对比体外培养与体内阴道代谢物是否一致。在校正了背景培养基浓度后，通过DESI-MS在培养菌落拭子中检测到27种与体内鉴定相同的代谢物(图5)。大约一半的代谢物的检测水平低于培养基背景对照，而其余代谢物的检测水平高于培养基背景。然而，在体外培养菌群的这些代谢物的DESI-MS水平和CST成员与活检观察到的水平之间没有明显的关系。
图5：通过DESI-MS检测到的27种体内的特异性代谢产物
3. 直接拭子DESI-MS法评估宿主粘膜间的免疫应答反应
作者使用VMET2队列样本的一个子集（共391个拭子样本），检测了22种可溶性免疫标志物，包括细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白和补体系统组成成分等（图6A）。采用随机森林回归分析，利用DESI-MS衍生的特征来预测每个标记物的对数转换浓度。
最终观测到免疫标记物的CVR2 > 0.1 (n = 9)和DESI-MS特征与免疫标记物的线性回归(n = 23)，显示代谢特征与局部免疫表型密切相关，主要特征是长链脂肪酸、甘油磷脂和神经酰胺水平的改变(图6B)。
DESI-MS预测和免疫分析测定的C3b、IL-1β、IgG2和IgG3水平在乳酸菌缺失的阴道微生物群中均升高，表明局部先天和适应性免疫应答的激活（图6C）。
图6：使用直接拭子DESI-MS评估宿主粘膜间的免疫反应
4. 直接拭子DESI-MS法作为早产风险分层的潜在工具
作者结合VMET1和VMET2患者队列的所有可用数据，研究了DESI-MS预测的妊娠结果、VMC和炎症状态之间的关系。使用16s 扩增子测序法定义了LDOM和LDEPL的阴道菌群类型，发现与在整个妊娠期间保持乳酸菌优势（LDOM）的妇女相比，妇女妊娠期间阴道菌群的高多样性和不稳定性（如妊娠期间阴道菌群类型由LDOM向LDEPL变化），与早产风险增加相关（比值比（OR）1.97，95%置信区间（CI）1.03-1.66，p=0.04）（图7A）。
通过免疫测定法直接测定或通过DESI-MS法预测IL-1β水平升高与足月分娩或早产妇女的VMC高度多样性有关（图7B,C），而MBL水平升高与早产妇女的VMC高多样性有关（图7C）。
图7：阴道微生态失衡和免疫激活与宫颈环扎术后早产风险和不良妊娠结局相关
作者随后将分析集中在更可能与阴道微生物-宿主相互作用失调相关的早产表型上，对比了在宫颈环扎术中使用辫状编织材料和使用单丝环扎材料进行手术的两类早产高风险妇女，研究结果发现与术中使用单丝缝合的女性相比，使用编织材料进行宫颈环扎术的患者阴道MBL水平最常升高(图7D)，使用DESI-MS法分析阴道拭子的VMC和MBL水平时，也检测到了类似的情况。免疫测定的结果也表明编织环扎插入后IL-1β升高（图7E），但DESI-MS预测检测的一致性较差。在用编织环扎材料治疗后，DESI-MS准确地预测了足月分娩的妇女与随后分娩的早产妇女相比IL-5β水平较低（图7F）。
小Q提示
作者通过利用宫颈阴道粘膜内的菌群和代谢物信息来提供VMC的可靠检测并同时估计宿主免疫和炎症状态。这本研究中，作者使用DESI-MS检测法对VMC进行预测，能够监测阴道微生物组的多样性及在整个怀孕期间的稳定性，最终达到预测早产风险分层，优化预防性干预措施的效果。总之，作者的研究表明，直接拭子上的DESI-MS可以快速、可靠地评估反映在宫颈-阴道粘膜代谢组中的阴道微生物群-宿主免疫相互作用。
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