一、抗原检测法
通过抗原抗体特异性结合的免疫学原理，以病毒的特定蛋白结构作为抗原，使用特异性抗体进行检测，可确定人体或动物体内是否存在病毒感染。基于抗原的检测常用方法有ELISA、免疫印迹法、免疫荧光分析以及胶体金免疫层析检测等。抗原检测法适用于病毒感染的早期诊断，可以快速获得结果。马家秀等开发了1种HBV核心相关抗原定量检测试剂盒，检测灵敏度为1.43 pg/ml，能够较准确地反映慢性乙型肝炎患者血清中的抗原水平，在辅助治疗和监测判定治疗重点等方面具有重要的应用价值。Wang等以水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白E为目标抗原开发了1种针对该病毒的胶体金检测试纸，检出下限为30 ng/ml，该方法具有操作简单、成本较低的优势，适用于大规模筛查和快速诊断。 然而，抗原检测法的灵敏度易受到环境因素和受试者自身因素的影响，例如当患者接种了针对相应病原体的疫苗后，短时间内进行抗原检测可能造成假阳性；抗原抗体特异性结合的最适pH约为6~9，如患者在咽拭子样本采集前食用了酸性或碱性食物则可能导致假阴性；当患者自身产生的特异性中和抗体亲和力高于检测用抗体，同样可能造成假阴性。
二、PCR
PCR是一种常用的病毒检测方法，通过将病毒的DNA片段特异性扩增，对样品进行琼脂糖凝胶电泳来观察扩增结果从而判断样品中病毒的存在。其扩增产物量以指数方式增加，经过30~40个循环后理论上1个靶DNA分子可扩增至10亿个。由于基因的特异性，核酸检测可以快速获得高度准确的检测结果。且可根据目的片段的长度不同，在同一检测体系内同时检测多个病毒。门旭坤等建立了1种可以同时检测3种导致猪呼吸道综合征病毒的多重PCR方法，检测下限约为2×105 拷贝，且特异性良好，可用于3种病毒的临床快速检测与流行病学调查。
然而，对于PCR扩增结果只能观测到不同大小的DNA片段，难以进行底物的准确定量，且PCR技术需要严格的实验条件，包括实验室设备、环境条件和专业的操作人员。
三、定量PCR（quantitative PCR，qPCR）
qPCR是在PCR技术的基础上发展出来的，其原理是在PCR反应体系中加入荧光物质以实现对目的核酸片段扩增的实时定量。qPCR检测荧光强度可直接在电脑中读取并处理数据，比PCR简便；且相比PCR，qPCR可对病毒进行精确定量，判断样品中的病毒载量。qPCR根据添加荧光物染料的原理不同，一般又可分为荧光染料法和TaqMan探针法。
SYBR Green Ⅰ染料可与双链DNA结合并发出较强荧光，因此荧光强度与体系中扩增片段浓度呈线性关系，可计算得到待测底物中的病毒量。陈佳圣等建立鸡圆环病毒的SYBR Green ⅠqPCR检测方法，检出限为287 拷贝/μl，灵敏度比常规PCR高100倍。此方法成本相对较低，只需要针对目的片段设计特异性的引物即可进行检测。由于染料与双链DNA的结合是非特异性的，每次实验只能针对1种病毒进行检测，且可能出现非特异性扩增造成假阳性。
TaqMan探针法则是在1段与目的扩增片段特异性结合的探针两端分别添加荧光基团和淬灭基团，当两基团连接在1条探针链上时，荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。探针在扩增过程中被Taq酶切割，使两端基团远离，从而能检测到荧光信号，且荧光强度与扩增目的片段数量成正比。张峰等建立检测人疱疹病毒6型、7型的单一实时qPCR方法，检测下限达到103 拷贝，检测灵敏度高于常规PCR方法。与荧光染料法相比，TaqMan探针法可避免非特异性扩增的干扰，特异性更强；还可针对多个的目的片段分别设置携不同荧光信号的探针，同时检测多个目的片段，提高检测准确性的同时还提升了检测效率，可以对同一样本同时检测多种病毒。但其特异性的探针需要定制，投入成本较前者高。此外，qPCR法测得结果中包含已失活病毒颗粒的DNA含量，无法判断病毒的感染活力。
四、反转录PCR（reversal transcription PCR，RT-PCR）
由于有些病毒的基因组由RNA组成，因此不能直接进行PCR检测，必须先将RNA逆转录得到相应的互补DNA，再进行扩增步骤。RT-PCR方法同样可以结合荧光染料或探针对目的片段进行实时定量分析，称为RT-qPCR，该法同样具有特异性强、灵敏度高的特点。张伟等建立了1种结合荧光染料的柯萨奇病毒B组3型RT-PCR检测法，特异性良好，检测范围101~109 拷贝/ml。Yan等建立了1种结合探针的多重RT-PCR技术，可同时检测禽流感病毒H1、H2、H3亚型，检测下限达到10~100 拷贝。除了用于定量病毒基因组，针对mRNA的特异性检测还可用于测定不同时期或组织中特定基因的转录活跃程度，这对于探索病毒的生物学活性机制具有很大的帮助。Bartolomeo等将新型冠状病毒接种于不同组织来源的人源细胞系，并通过RT-PCR检测病毒入侵细胞的重要受体和辅助蛋白受体血管紧张素转换酶2、跨膜丝氨酸蛋白酶2的mRNA，来评估其在不同人体组织中的表达活跃程度，以探究新型冠状病毒对人体的器官或组织嗜性。
由于RNA的单链结构不稳定易在体外分解，可能造成检测结果偏低，因此在检测和样品储存上对实验人员操作及环境的洁净度有较高的要求，在一定程度上提高了成本。
作者
曹鹤霄综述
李冬梅审校
上海生物制品研究所有限责任公司第七研究室，200051 上海
通信作者：李冬梅
文章有删减
