2025 年 Jason B. Pieper 等人发表于《Veterinary Dermatology》的研究，对 9 只患有浅表细菌性毛囊炎（SBF）且存在非渗出性病变（13 个结痂、6 个表皮环）的犬，将每个病变分两半分别用干无菌拭子和生理盐水浸泡的无菌拭子取样（各滚动 4 次）并进行需氧定量培养，结果显示生理盐水浸泡拭子的平均葡萄球菌计数（4.41 Log₁₀ cfu/mL）显著高于干拭子（3.83 Log₁₀ cfu/mL，p=0.002），证实生理盐水浸泡的细菌培养拭子能提高犬 SBF 非渗出性病变的细菌回收率。
摘要
背景： 犬浅表细菌性毛囊炎是一种常见的复发性疾病，由于抗菌药物耐药性增加和抗菌药物管理的要求，越来越需要进行培养和药敏试验。关于理想的培养样本采集技术，存在不同意见，该技术随病变特征而异。
目的： 确定在采集SBF的非渗出性临床病变（结痂和表皮环）样本时，使用干培养拭子和生理盐水湿润的培养拭子所回收的细菌数量是否存在差异。
动物： 招募了9只患有结痂或表皮环且细胞学检查结果符合SBF的犬。
材料与方法： 每个临床病变被分成两半。一半病变用干燥的无菌棉签取样，而另一半用饱和无菌生理盐水的无菌拭子取样。每个病变用培养拭子在其对应的一半上滚动四次进行取样。然后进行需氧定量培养以确定存在的葡萄球菌类菌落数量。
结果： 总共评估了19个病变（13个结痂和6个表皮环）。干培养拭子鉴定出的平均葡萄球菌细菌计数为3.83 Log10 菌落形成单位（cfu）/mL（标准差[SD] = 0.70）。生理盐水浸泡的培养拭子显示的中位细菌计数为4.41 Log10 cfu/mL（SD = 0.77）。样本采集方法之间存在统计学显著差异（p = 0.002）。
结论与临床相关性： 与干拭子相比，使用无菌生理盐水浸泡的拭子更有可能从非渗出性病变中回收更多的细菌。
关键词
结痂，培养，犬，表皮环，葡萄球菌，浅表细菌性毛囊炎
引言
犬浅表细菌性毛囊炎（SBF）是一个常见问题，源于多种潜在的原发性疾病，最常见的是过敏性皮炎、内分泌疾病（甲状腺功能减退或肾上腺皮质功能亢进）和免疫介导性疾病。
与犬SBF一致的临床病变包括丘疹、脓疱、结痂和表皮环。与犬SBF一致的细胞学发现包括中性粒细胞伴有细胞内和/或细胞外球状细菌。1 最常分离到的微生物是葡萄球菌属，但其他菌属如链球菌、棒状杆菌和假单胞菌也可能起作用。抗菌药物管理日益受到重视，并已制定SBF诊断和治疗的共识指南。对于SBF病例，局部治疗被认为是理想的一线疗法。如果对局部治疗反应不佳或客户无法进行局部治疗，全身性治疗是下一个选择。1 一线肠外抗菌药物（头孢氨苄、克林霉素、阿莫西林-克拉维酸）可能作为治疗SBF的成功经验性全身疗法，但随着时间的推移，甲氧西林耐药和多药耐药的发生率有所增加。2
当SBF对局部治疗或经验性一线抗菌药物治疗无效时，怀疑存在抗菌药物耐药性，建议进行细菌培养。脓疱相对容易培养，方法是刺破病变并将干燥的无菌培养拭子应用于脓疱的脓性内容物。在没有脓疱的情况下，带有渗出物的结痂是下一个合乎逻辑的采样病变。1 有些病例可能只有结痂或表皮环而没有渗出物，这可能使得细菌检测和采样效果不佳。已知在采集表皮环样本时，在表皮环的前缘下方检测到的微生物数量最多。3 这使其成为细胞学评估和培养的理想采样部位。
一个临床难题是当细胞学结果显示存在细菌，而培养结果却显示疑似病变无生长。这对临床医生来说可能令人沮丧，因为它没有提供有用的诊断价值。一些作者曾亲身经历或通过病例咨询遇到过这种情况。先前的一份出版物讨论了由于抗生素治疗抑制某些微生物生长而导致假阴性培养的担忧。4 另一种可能性是无法通过培养检测到少量细菌。先前在患有外耳炎的犬以及患有唇炎的犬中已注意到细胞学结果与培养结果之间的差异。5,6 此外，还引入了新的诊断分子方法，包括下一代测序和PCR。先前的研究表明，与临床病变的细菌培养相比，这些方法能检测到更多的细菌。尽管如此，该研究中这些方法之间的抗菌药物敏感性存在显著不一致。7 如果使用新的诊断分子方法，细菌培养无法检测到少量细菌，那么我们需要优化采样技术以最大化这一诊断工具的价值，这可能会对临床实践和抗菌药物管理产生重大影响。
先前进行了一项研究，比较了无菌干培养拭子、无菌生理盐水湿润的培养拭子以及浸在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中的皮肤刮取物在采样各种SBF临床病变时的效果。8 结果确定所有三种培养方法都产生了良好的检出率，但并未比较特定方法是否对特定临床病变更好。这项先前的研究评估了细菌的存在与否，而不是微生物的数量，并且并非所有病变类型都使用了每种方法进行采样。
本研究旨在比较使用干培养拭子与无菌生理盐水湿润的培养拭子从SBF相关的非渗出性临床病变（结痂和表皮环）采样时回收的细菌数量。我们假设无菌生理盐水湿润的培养拭子将显著增加从这些类型病变中回收的细菌数量。
材料与方法
动物与纳入标准
如果到爱荷华州立大学Hixson-Lied小动物医院就诊的犬具有提示SBF的临床病变，包括表皮环和结痂，则被招募入组。需要细胞学结果来诊断活动性感染。必需的细胞学发现包括中性粒细胞伴有细胞内和/或细胞外细菌微生物，其中以形成成对或簇状的球状细菌为主。所有主人在入组前都提供了知情书面同意，同意将其犬纳入研究。本研究方案经爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会批准。
样本量
在研究前进行了样本量计算，以确定本研究所需采样的病变数量。基于初步数据，种群数为1.65x10⁷ cfu/mL，标准差为4.5 x10⁶ cfu/mL，我们旨在能够检测到25%的微生物变化，并设定β为0.8，α为0.05。这确定需要采样19个临床病变。
培养采样方法
一旦确定临床病变，将其随机分成两半。使用随机数生成器决定左半部分使用哪种采样方法，右半部分则使用另一种方法采样。对于所有病变，总是先采样左半部分。一半病变使用干燥的无菌棉签（Copan拭子）采样，而另一半使用饱和无菌生理盐水的干燥无菌棉签（Copan拭子）采样。通过将拭子在指定的一半病变上滚动四次（包括表皮环边缘下方，如果存在）来对病变进行采样。使用层压纸片垂直地将病变分成两半，并在采样过程中防止重叠，如图1所示。该层压片在采样临床病变之间和动物之间用酒精清洁并晾干。由一名研究人员对所有病变进行采样，以保持采样方法一致。然后将无菌拭子放入其提供的运输管中，并在处理前在4°C的冰箱中储存5-60分钟。
图1 临床病变被黑色竖线分为左右两半，该竖线为放置层压片进行采样的位置
细菌定量
由另一位对采样技术不知情的研究人员进行细菌定量。每个培养拭子在1.0 mL PBS溶液中冲洗，以将细菌洗脱到溶液中。然后将这些溶液进行系列稀释并接种在血琼脂平板上。每个溶液的稀释因子为10倍，进行六次系列稀释。每个溶液进行三次重复评估。所有血琼脂平板在37°C有氧条件下培养24小时。此后，鉴定出具有合适形态（小、圆形、灰色至白色菌落，边缘光滑）和存在双溶血环（符合凝固酶阳性葡萄球菌特征）的理想平板（含有20-70 cfu菌落），并进行计数。然后确定平均浓度（cfu/mL）。9
细菌鉴定
从临床病变获取初始的干拭子和生理盐水浸泡拭子后，再用一个干培养拭子用力在整个病变上摩擦四次。该样本提交至爱荷华州立大学兽医诊断实验室，以盲法方式鉴定病变上存在的所有细菌种群。所有微生物均通过基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）测试进行鉴定。甲氧西林耐药性根据临床与实验室标准协会（CLSI）标准（CLSI VET01S Ed 5）进行评估。10
统计分析
原始数据呈偏态分布，随后进行以10为底的对数（Log10）转换。转换后的数据使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。由于数据呈正态分布，进行了配对样本t检验。统计学显著性设定为p≤0.05。使用SPSS Statistics v27（IBM Corp.）进行所有统计分析。
结果
从9只犬总共采样了19个病变（13个结痂和6个表皮环）。所有原始数据可在支持信息的表S1中找到。评估显示，在同一采样方法下（即所有犬的干培养和所有犬的生理盐水浸泡培养），不同犬只之间没有显著变异性。这表明数据在犬只间相对均匀分布。干培养拭子与生理盐水浸泡培养拭子的数据如图2所示。
该箱线图展示了使用干培养拭子与生理盐水浸泡培养拭子所获的细菌计数（Log10 菌落形成单位/毫升）对比。箱体本身代表数据的四分位距（IQR），即中间50%的数据范围。箱体内的线表示中位数。须线（从箱体延伸出的直线）显示除异常值外的数据范围。图中标示出了干培养拭子组的一个异常值；生理盐水浸泡培养拭子组的两个异常值未在图中显示。
对于转换后的干培养拭子数据，平均细菌计数为3.83 Log10 cfu/mL（SD = 0.70）。对于转换后的生理盐水浸泡培养拭子数据，平均细菌计数为4.41 Log10 cfu/mL（SD = 0.77）。培养方法之间存在统计学显著差异（p = 0.002）。
生理盐水浸泡培养拭子方法在19个病例中的17个显示出比干培养方法更高的细菌计数。与干培养方法相比，细菌计数的增加幅度为1342.01%（SD = 3036.04%）。由于检测到的细菌数量范围很大，我们进一步将结果分成不同的范围，如图3所示。在较低浓度（<1000 cfu/mL）下，细菌的增加没有统计学显著性（p = 0.065）。这可能是样本数量少的结果。理想情况是每个范围包含19个病变。两个较高浓度的细菌增加百分比较小，但两个范围均显示出统计学显著的增加。与干培养方法相比，生理盐水浸泡培养拭子细菌检出率的统计学显著增加在表皮环（增加1403%，p = 0.028）和结痂（增加1313%，p = 0.015）之间相似。
根据提交至爱荷华州立大学兽医诊断实验室进行鉴定的拭子，每个培养样本都能够鉴定出根据细胞学结果怀疑存在的葡萄球菌属。19个样本中的15个鉴定出伪中间葡萄球菌，而其余4个样本鉴定出施氏葡萄球菌。19个样本中的13个检测到其他临床相关微生物，包括链球菌属和棒状杆菌属。9只犬中的6只有多个临床病变被采样，其中6只犬中的5只，每个病变培养鉴定的细菌种类相同。6号犬的所有病变都鉴定出伪中间葡萄球菌，但三个病变中只有两个鉴定出耳蜗棒状杆菌。培养鉴定的临床相关细菌种类数量与两种采样方法间平板计数变异性没有相关性（p = 0.075）。
19个样本中的14个检测到耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。当一只犬有多个病变被采样时，每只犬的甲氧西林耐药模式相同（6只犬中的5只为MRS，6只犬中的1只为甲氧西林敏感葡萄球菌[MSS]）。当按甲氧西林耐药性分离数据时，对于MRS（p = 0.03）和MSS（p = 0.025），检测到的细菌数量仍然存在统计学显著差异。
讨论
早期对患有表皮环的犬SBF的调查研究使用干培养拭子，从患病犬的病变部位鉴定出中间葡萄球菌（先前包括伪中间葡萄球菌，现已被分为独立物种），但从健康犬的腹部皮肤未鉴定出微生物。11 在皮肤微生物组研究中，通常使用湿润的培养拭子来检测健康犬和患病犬皮肤中的细菌。12-14 我们认为这些研究表明，与干培养拭子相比，使用生理盐水湿润的培养拭子增加了从非渗出性、未受影响皮肤回收细菌的能力。当结痂和表皮环为主时，本研究证明使用生理盐水湿润拭子可以增加回收的细菌数量。在人类医学中，一致建议是在进行皮肤培养时使用无菌生理盐水浸泡的培养拭子。事实上，已发布的人类伤口培养临床指南建议，当临床病变为非渗出性时，用无菌生理盐水或培养基湿润拭子。15
另一种描述从皮肤回收细菌的方法是擦洗法。这是通过引入液体连同器械来擦洗并松动人类或动物皮肤上的微生物。在1976年进行的一项研究之前，人们认为培养拭子是从人类皮肤回收细菌的不可靠方法。该研究表明，浸泡在稀释液中的培养拭子对于微生物的检测和回收与擦洗法一样好。16 与当前采样或建议相比，一个值得注意的区别是，培养拭子在稀释液中冲洗，并且在采样过程中多次擦拭皮肤。另一项评估患有脂溢性皮炎的猎浣熊犬的研究显示，使用 detergent scrub 法和生理盐水湿润培养拭子在皮肤上擦拭5秒所得的细菌计数高度相关。17 显然，可能存在影响培养拭子方法的变量，例如擦拭皮肤时施加的压力、渗出物的量以及擦拭的时间。目前，缺乏评估这些变量对最终培养报告结果影响的研究。
两种培养拭子方法均能在所有病例中培养出细菌，但生理盐水浸泡拭子方法的细菌数量在统计学上更高。回收更多数量的细菌在临床病变中存在多种微生物时可能很重要。理论上，更高的细菌回收率可能会增加鉴定出抗菌药物耐药性的机会；然而，由于通常仅使用单个菌落进行抗菌药物敏感性测试，这一假设需要进一步验证。理论上，更高的微生物数量可能会增加检测到表达耐药性细菌的机会。先前一项比较半定量和细菌载量的皮肤活检培养分析揭示了培养更高数量细菌的重要性。18 该先前报告显示的差异为1x10² cfu/mL，这可能导致半定量生长量表（无生长、少量、轻度、中度、重度）中一个或两个级别的变异性。某些微生物的较低生长水平在临床医生解读时可能被错误地认为不重要。葡萄球菌属被认为是皮肤的正常菌群，因此作者经常利用实验室报告的细菌生长量作为判断葡萄球菌在临床感染中起作用可能性的替代指标，而不是正常菌群。基于采样技术的细菌回收差异会影响实验室报告的细菌生长程度，18 进而可能影响临床决策。此外，当选择菌落进行药敏试验时，数量较少的微生物可能会被更主要的微生物过度生长而遗漏。虽然我们的研究未显示较低生长水平样本的统计学显著差异，但这可能是由于仅在较低范围内采样了三个临床病变。这三个样本确实显示使用生理盐水浸泡培养拭子方法细菌数量增加了55倍；因此，进行一项评估较低细菌数量的更大规模研究将更有利于进一步研究这一点。
本研究的一个潜在限制是样本量小，但研究前进行了样本量计算。包含更多低细菌数量的样本可能更理想，但如果不使研究者知情并引入偏倚，则无法控制这一点。有两个病例使用无菌生理盐水湿润培养拭子与干培养拭子相比，细菌检出率确实有所下降。其中一个非常相似（干培养拭子为1.4x10⁴ cfu/mL，无菌生理盐水培养拭子为1.2x10⁴ cfu/mL），细菌数量减少了15.4%，而另一个则减少了85.5%。尽管病变被分成两半并均匀采样，但始终存在细菌在病变内分布不均匀的可能性。先前已表明，在大多数犬中，表皮环前缘的细菌数量更高，尽管在整个病变中都能检测到一些细菌。3 我们试图通过尽可能均匀地采样病变、始终擦拭相同次数来尽可能控制这种变异性。此外，由一名研究人员采集所有样本，以尽可能标准化方法和所使用的压力。有些犬被采样了两个或三个临床病变。当将这些样本合并到每只犬并进行结果比较时，采样方法之间仍然存在统计学显著差异（p = 0.011）。在理想情况下，每只犬可以只采样一次，以完全消除该因素。另一个本应有益评估和关联的比较是细胞学严重程度与细菌数量之间的相关性，因为这可以使未来的研究能够根据细胞学结果专注于特定范围。不幸的是，细胞学结果仅记录为存在或不存在球状细菌。
假定这种方法在增加所有细菌种类的数量方面是相同的，但我们专注于葡萄球菌属。有些平板上生长了多种微生物，我们计数了外观与我们实验室预期的葡萄球菌属相似的菌落。不幸的是，我们没有对我们的系列稀释平板进行MALDI-TOF分析，以验证与我们实验室鉴定的微生物与爱荷华州立大学兽医诊断实验室鉴定的微生物完全相同。这样做是因为我们希望将每个病例的临床样本提交给诊断实验室进行需氧培养和药敏试验。采样进行多次培养并通过多个实验室获得结果的可重复性和一致性一直是一个问题，尤其是在讨论耳部培养时。5,19 一项新研究表明，当细胞学结果中鉴定出球状细菌时，葡萄球菌属的检测在大多数实验室中具有高度可重复性（80%-100%）。20 基于该研究，我们有信心认为结果一致地鉴定出了细胞学评估中观察到的相同微生物，并且与爱荷华州立大学兽医诊断实验室相比，我们的系列稀释物是相同的微生物。这里的每个病例都鉴定出了葡萄球菌属，这进一步支持了研究结果，因为病变被多次采样。
结论
我们的研究结果表明，与干培养拭子相比，使用无菌生理盐水浸泡的培养拭子可以从患有SBF的犬的表皮环和结痂中回收更多的细菌。基于这一发现，应建议在采样诊断为犬SBF的犬的非渗出性临床病变时，使用无菌生理盐水浸泡的培养拭子，以优化培养结果，并最大化培养和药敏试验的诊断价值。基于本研究的这项建议，将与人类医学当前的临床指南保持一致。
